Използване на компютърна морфометрия в туморната диагностика

от Д-р Радостин Симеонов

Март, 2006

В настоящата публикация са разгледани ролята и значението на компютърната морфометрия в туморната диагностика и по-специално в диагностиката на епителните мамарни неоплазии при кучката. Резултатите от проучванията показват, че метода може да се използва за преоперативно отдиференциране на доброкачествените от злокачествените епителни тумори на млечната жлеза при кучката.

Въведение

През последните години във ветеринарната медицина се наблюдава значителен прогрес в развитието на клиничната патология. Това се свързва с практическата интродукция на имунохистохимията, флоу-цитометрията, молекулярната диагностика и компютърният анализ. Сравнително ново направление в онкологията е използването на компютърна морфометрия за диагностични цели. При този метод телевизионна или дигитална камера, свързана към светлинният микроскоп заснема цитологичната или хистологичната находка. Впоследствие "дигитализираната" находка се обработва с помоща на софтуер, който определя размерите, формата, разположението, плътността и други параметри на проучваните обекти. Изследваните морфометрични показатели могат да бъдат разделени на четири групи - прости параметри (площ, диаметър, периметър), показатели, определящи формата на обекта (фактор за симетрия и изпъкналост), двуфазови показатели (ядрено-цитоплазмено съотношение и ексцентричност) и показатели, определящи структурата на обектите. Използването на компютърен морфометричен анализ в патологията има редица предимства. На първо място изследването на находката става по определени протоколи, а това води до стандартизация на получените резултати. На второ място по този начин се откриват морфометрични разлики между обектите, които не могат да бъдат доловени с просто око. На трето място броят на измерваните обекти може да бъде неограничен, което на практика не може да бъде осъществено при рутинната морфометрия, поради нейната трудоемкост. Не на последно място получените резултати се обработват лесно статистически; нещо повече - създадени са компютърни програми, които значително улесняват изследователите. Освен това станa възможно изследванетo и на други показатели, които не могат да се определят при класическият морфометричен анализ, като закръгленост на ядрото и фрактално измерение на ядрото, за които е известно че имат диагностична стойност в онкологията.

Целта на настоящето проучване бе да се установи дали компютърно-детерминираният морфометричен параметър площ на ядрото може да се използва за преоперативно отдиференциране на доброкачествените от злокачествените епителни тумори на млечната жлеза при кучката.

Материали и методи

Изследванията бяха проведени върху материали от спонтанни тумори на млечната жлеза от кучки, приети за преглед и лечение в клиниката по хирургия и клиниката по акушерство към Ветеринарномедицински факултет, Тракийски Университет - Стара Загора, както и от частни ветеринарни амбулатории от Югоизточна България. Общо бяха изследвани тридесет мамарни тумора и седем контроли. Материалите за цитологично изследване, получавани преоперативно посредством тънкоиглена аспирационна биопсия (ТАБ) бяха фиксирани незабавно с помоща на Merckofix spray (Merck, Germany) и оцветени с Hemacolor (Merck, Germany). ТАБ беше извършена върху четири различни участъка от туморните формации. Впоследствие от всеки тумор се вземаше материал за хистологично изследване и всички изследвани неоплазии бяха класифицирани съгласно WHO Histological Classification of Mammary Tumors of the Dog and Cat. Дигиталните снимки на неопластичните клетки бяха направени с помоща на Motic Professional B3 Digital Microscope (Motic , China Group Co, Ltd). От измерването бяха изключени всички деформирани, разкъсани или припокрити клетъчни ядра. Заснемането на цитологичната находка беше извършено при увеличение 1000x, a резолюцията на дигитализираната микроскопска находка бе 1024/768 пиксела при всички изследвани случаи. От всеки тумор, включително и контролите изследвахме най-малко по 100 ядра на епителни клетки. Автоматизираният количествен анализ беше извършен с помоща на програмата Image Pro Plus (Image Pro Plus 4.5.0.29. for Windows 98/NT/2000, Media Cibernetics, USA) - фиг.1, фиг. 2, фиг. 3, фиг. 4. Ядрата на клетките бяха подбирани случайно от програмата. Image Pro Plus разполага с програма за дескриптивна статистика, т.е това бе напълно достатъчно за първоначална статистическа обработка на получените резултати. За по задълбочени статистически изследвания данните от получените резултати бяха конвертирани във формат "exl", след което бяха прехвърляни за окончателен анализ с помоща на АNOVA LSD post hoc test от програмата Statistica 6.0. (Statistica 6.0, StatSoft, USA).

Резултати и дискусия

Aнализa на получените резултати показа, че морфометричният показател площ на ядрото може да се използва за преоперативна диагностика на доброкачествените от злокачествените мамарни епителни неоплазии при кучката. Нещо повече - постепенното нарастване на числените стойности на параметъра показват, че компютърният морфометричен анализ би могъл да се използва и за определяне степента на злокачественост на епителните мамарни тумори.

Условията на практиката изискват бързи диагностични методики. Това се отнася в особено голяма степен до туморната диагностика. От практическа гледна точка за хирурга е необходимо да знае не точното типизиране на туморната формация а това дали тя е доброкачествена или не, за да може да реагира адекватно (далеч съм от мисълта да игнорирам ролята на рутинното хистологично изследване за поставянето на окончателна диагноза - напротив резултатите от двете изследвания трябва взаимно да се допълват !). Рутинният начин за диагностика на неоплазиите е хистологичното изследване. То е сравнително бавно, тъй-като изисква инвазивно вземане на материал (биопсия), фиксиране и по-нататъшна обработка. Бърз начин за диагностика на туморните формации е цитологичното изследване, а напоследък - и компютърният микроскопски анализ. Въвеждането на компютърни технологии в медицината има не само научно, но и чисто практическо значение. Компютърната морфометрия позволява на практика преминаване от описателна микроскопия към количествен анализ на микроскопските обекти. Целта е една - поставяне на бърза диагноза.

Компютърната морфометрия може да се използва за хистологични и цитологични цели, но за да има метода клинично приложение той трябва да се използва преоперативно, т.е. върху цитологични препарати. Повечето изследователи, включително и ние сме на мнение, че за да може изследването да е обективно, трябва да се изследват морфометрично минимум по сто ядра на клетки от един и същ материал. За да може да се внедри метода в практиката е необходимо да има стандартизация на процедурите при фиксиране и оцветяване на материала за цитологично изследване. В диагностичен аспект не по-малко важна е колаборацията между клинициста и патолога, която за съжаление се среща рядко у нас. Цената на тази колаборация си заслужава, заради ползата от нея за нашите пациенти.

P.S

От четири години автора работи по проблемите, свързани с цитологичната диагностика и използването на компютърен анализ в туморната диагностика при животните за компания. У нас това е едно начало в развитието на клиничната патология при дребните животни. Автора благодари на всички колеги от практиката за оказаното му съдействие и доверие и се надява, че и занапред ще работят заедно.

Литература

1. Симеонов, Р., 2005. Интерпретация на цитологичната находка при животните за компания. Ветеринарномедицински новини. бр. 3-4,
2. Симеонов, Р., 2005. Цитологична находка при спонтанни неоплазии, развиващи се в млечните жлези на кучките. Научна конференция с международно участие, Стара Загора-2005.
3. Симеонов, Р., Стойков, Д., Симеонова, Г., Вачков, А., 2005 Цитологична находка при нетуморни патологични процеси, развиващи се в млечните жлези на кучките. Научна конференция с международно участие, Стара Загора-2005.
4. Симеонов, Р. Цитологичната диагностика във ветеринарната медицина. Veterinary Medicine, Vol.VIII, № 3-4, 56-59, 2004.
5. Симеонова, Г., Симеонов Р. и С. Кръстев. Техника на тънкоиглената аспирационна биопсия при животните за компания. Veterinary Medicine, Vol.VIII, № 3-4, 60-66, 2004.
6. Chieco, P., 2001. Image capturing. In: Chieco, P., Jonker, A., van Noorden, C., (eds), Image cytometry. BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, pp. 7-31.
7. Ciurea, D., Wilkins, R., Shalev, M., Liu, Z., Barba, J., Gil, G., 1992. Use of computerized interactive morphometry in the diagnosis of mammary adenoma and adenocarcinoma in dogs. American Journal of Veterinary Research 53, 300-303.
8. Destexhe, E., Bicker, E., Coignoul, F., 1995. Image analysis evaluation of ploidy, S-phase fraction and nuclear area in canine mammary tumors. Journal of Comparative Pathology 113, 205-216.
9. Destexhe, E., Vanmanshoven, P., Coignoul, F., 1995. Comparison of argyrophilic nucleolar organizer regions by counting and image analysis in canine mammary tumors. American Journal of Veterinary Research 56, 185-187.
10. De Vico, G., Maiolino, P., 1997. Prognostic value of nuclear morphometry in feline mammary carcinomas. Journal of Comparative Pathology 117, 99-105.
11. De Vico, G., Sfacteria, A., Maiolino, P., Mazzullo, G., 2002. Comparison of nuclear morphometric parameters on cytologic smears and histologic sections of spontaneous canine tumors. Veterinary Clinical Pathology 1, 16-18.
12. Griffey, S., Verstraete, F., Kraegel, S., Lucroy, M., Madewell, B., 1998. Computer-assisted image analysis of intratumoral vessel density in mammary tumors from dogs. American Journal of Veterinary Research 59, 1238-1242.
13. Hamilton, P., Allen, D., 1995. Morphometry in histopathology. Journal of Pathology 175, 369-379.
14. Harmelin, A., Zuckerman, A., Nyska, A., 1995. Correlation of Ag-NOR protein measurements with prognosis in canine transmissible venereal tumours. Journal of Comparative Pathology 112, 429-433.
15. Hung, L., Pong, V., Cheng, C., Wong, F., Chu, R., 2000. An improved system for quantifying AgNOR and PCNA in canine tumors. Anticancer Research 20, 3273-3280.
16. Juntes, P., Pogacnik, M., 2000. Morphometric analysis of AgNORs in tubular and papillary parts of canine mammary gland tumors. Analytical and Quantitative Cytology and Histology 22, 185-192.
17. Kent, M., Griffey, S., Verstraete, F., Naydan, D., Madewell, B., 2002. Computer-assisted image analysis of neovascularization in thyroid neoplasm from dogs. American Journal of Veterinary Research 63, 363-369.
18. Maiolino, P., Papparella, S., Restucci, B., De Vico, G., 2001. Angiogenesis in squamous cell carcinomas of canine skin: an immunohistochemical and quantitative analysis. Journal of Comparative Pathology 125, 117-121.
19. Maiolino, P., Restucci, B., Papparella S., De Vico, G., 2002. Nuclear morphometry in squamous cell carcinomas of canine skin. Journal of Comparative Pathology 127, 114-117.
20. Meijer, G., Belien, J., van Diest, P., Bank, J., 1997. Image analysis in clinical pathology. Journal of Clinical Pathology 50, 365-370.
21. Misdorp, B., Else, R., Hellmen, E., Lipscomb, T., 2001. Histological classification of mammary tumors of the dog and cats. WHO International Histological Classification of tumors of domestic animals, second edition, Vol VII Washington DC: Armed Forces Institute of Pathology, Americam Registry of Pathology.
22. Preziozi, R., Della Salda, L., Ricci, A., Simoni, P., Marcato, P., 1995. Quantification of nuclear organizer regions in canine perineal gland tumours. Research in Veterinary Science 58, 277-281.
23. Preziozi, R., Sarli, G., Paltrinieri, M., 2004. Prognosis value of intratumoral vessel density in cutaneous mast cell tumors of the dog. Journal of Comparative Pathology 130, 143-154.
24. Restucci, B., De, Vico G., Maiolino, P., 2000. Evaluation of angiogenesis in canine mammary tumors by quantative platelet endothelial cell adhesion molecule immunohistochemistry. Veterinary Pathology 37, 297-301.
25. Roels, S., van Diest, P., Belien, J., Ducatelle, R., 1998. Computerized image analysis in diagnostic veterinary pathology- is the era of descriptive veterinary pathology coming to an end ? European Journal of Veterinary Pathology 4, 21-27.
26. Roels, S., Van Daele, A., Van Marck, E., Ducatelle, R., 2000. DNA ploidy and nuclear morphometric variables for evaluation of melanocytic tumors in dogs and cats. American Journal of Veterinary Research 61, 1074-1079.
27. Simeonov, R. and G. Simeonova., 2006. Computerized morphometry of mean nuclear diameter and nuclear roundness in canine mammary gland tumors on cytologic smears. Veterinary Clinical Pathology, Vol. 35/ No. 1, 88-90.
28. Strefezzi, F., Xavier, J., Catao-Dias, J., 2003. Morphometry of canine cutaneous mast cell tumors. Veterinary Pathology 40, 268-275.
29. Wandemarin, K., Beletti, M., Costa, L., 2004. Nuclear morphometry of neoplastic cells as a method for diagnosis of histiocytoma, mastocytoma and transmissible venereal tumors in dogs. Real Time Imaging 10, 197-204.