Цитологичната диагностика във ветеринарната медицина

от Д-р Радостин Симеонов

Октомври, 2005

Въведение

Цитологичното изследване е бърз спомагателен метод за диагностика на различни заболявания, въз основа на клетъчната морфология. Най-често негов обект са клетки от дадена тъкан или орган, изменени в резултат на възпалителен процес или тумор. Периметърът на диагностичната цитология покрива част от телесните органи и тъкани. Въпреки, че нейната основна насоченост е туморната цитодиагностика, напоследък все повече се развива и така наречената нетуморна цитология. Цитологичната диагностика има много предимства. На първо място с нея се пести време - диагнозата в много случаи се поставя в рамките на няколко минути. Освен това бързо може да се определи дали се касае за неопластичен или възпалителен процес. Вземането на материал за цитологично изследване е сравнително неинвазивно за пациента - с това се избягват интервенции, свързани с риск за животното. В някои случаи това изследване се явява като единствен диагностичен метод - при изолирани и труднодостъпни лезии. Методът е евтин и с достатъчна диагностична стойност. Изтъквайки предимствата на цитологичното изследване не трябва да се омаловажа ролята на рутинното хистологично изследване - напротив резултатите от двете изследвания взаимно се допълват и контролират, за да се стигне до точна диагноза. За да се разчита на достоверността на цитологичното изследване е нужен голям изследователски опит.

Показания за извършване на цитологично изследване

Основните индикации за цитологичното изследване са отдиференцирането на възпалителните процеси, неоплазиите, хиперпластичните процеси, изследването на костен мозък и ефузии. За съжаление все още във ветеринарната медицина у нас до този метод се прибягва твърде плахо, въпреки широките му диагностични възможности. Поради тази причина, настоящата публикация разглежда най-важните моменти при получаването, оцветяването и изпращането на материал за цитологично изследване.

Получаване на материал за цитологично изследване

Важна стъпка преди вземането на материала е предварителната подготовка на предметните стъкла. Те трябва да бъдат почистени с равни части 96⁰ спирт и етер. Проби за цитологично изследване могат да се получат чрез отпечатъчни препарати, намазки, остъргване на материал, тампонни проби или тънкоиглена аспирационна биопсия (ТАБ). Техниката на вземането на материала зависи от анатомичната локализация на тъканта и вида на патологичното образувание. Желателно е да се направят поне 6-8 препарата, включително и такива, които в момента няма да се оцветяват, за да може при необходимост да се приложат и някои допълнителни методи на изследване (цитохимия, имуноцитохимия).

1.Отпечатъчни препарати

Отпечатъчният препарат се прави чрез нежно притискане на подсушената разрезна повърхност на материала към предварително почистеното предметното стъкло (Фиг.4) Така приготвеният препарат се оставя да изсъхне на стайна температура или се фиксира с 95 % етилов алкохол (в зависимост от начина на оцветяване). Отпечатъчни препарати за цитологично изследване могат да бъдат направени от повърхностни патологични образувания или от хирургически отстранени тъкани от оперирани животни. Те допълват хистологичната находка с данни, които остават скрити при патохистологичното изследване. Това е лесен начин за вземане на материал за цитологично изследване, но се получават значително по-малко клетки за изследване, отколкото при останалите методи. Освен това, материалите често се контаминират с бактерии и клетъчни остатъци. Мястото, от където ще се приготвят препаратите, се измива с хладка вода и антибактериален сапун или се тушира с тампон, напоен със спирт. Ако се касае за повърхностни язви, отпечатъчните препарати се правят преди тъканта да бъде обработена. Важно условие е материалът да не съдържа кръв и тъканни течности, тъй-като интерпретацията на цитологичната находка се затруднява. Допирането на отрязаната повърхност с филтърна хартия отстранява излишъка на кръв и тъканни течности. За тъкани с плътна консистенция прясно отрязаната повърхност се надрасква със скалпел.

2.Цитонамазки

Цитонамазки се правят от полутечни, слузоподобни тъкани или ефузии, след предварителното им ценрофугиране. Малка капка от материала се поставя върху почистено предметно стъкло, приблизително на около 1 см от неговият край. Второ предметно стъкло се поставя върху пробата и материалът бързо, но нежно се разстила между двете стъкла (Фиг.2). Целта е равномерното разстилане на клетките от дебел към тънък слой, за да се оптиминизира микроскопското изследване и клетъчната морфология. Не трябва да има моментна пауза при придвижването на предметното стъкло, тъй-като това се отразява зле върху качеството на препаратите. Натискът върху материала не трябва да бъде голям, тъй-като клетките се увреждат и се затруднява поставянето на обективна диагноза. Ако препаратите са прекомерно дебели трябва да се направят още няколко, а не да се опитваме да изтъним същесвуващите чрез допълнителен натиск.

3.Остъргване на клетъчен материал

Прилага се при плътни тъкани. При този метод след подготовката на тъканта се използва острие на скалпел, с чиято помощ се остъргва тънък слой от повърхността на лезията и се разстила върху предметното стъкло (Фиг.3). При този метод пробите често се контаминират вторично с бактерии. Освен това, често клетъчният материал е разкъсан, което намалява и диагностичната му стойност.

4.Тампонни проби

Методът се използва най-често при приготвянето на вагинални цитонамазки. Тампонът предварително се навлажнява със 0,9 % разтвор на NaCl, за да се намали рискът от разрушаване на клетките при получаване на пробата. Материалът се взема чрез леки въртеливи движения по повърхността на лигавицата. След тампонирането клетъчният материал нежно се разстила върху предметното стъкло.

5.Тънкоиглена аспирационна биопсия(ТАБ)

Това е предпочитан метод за получаване на клетъчен материал. По този начин се избягва повърхностното контаминиране на пробата, както при останалите методи. Има два вида ТАБ-аспирация на материала чрез смукване и аспирация на база капилярно налягане.

1.Аспирация чрез "всмукване":

Мястото, от където ще се аспирира, се забръсва, измива и тушира с тампон, напоен с алкохол. Използва се пластмасова спринцовка с вместимост 5-10 мл, към която е прикрепена игла 22 G. Иглите с по- голям лумен се избягват, тъй-като травматизират по-силно тъканта и предизвикват вътретъканни кръвоизливи. Тъканта, от която ще се аспирира, се фиксира и имобилизира между палеца и показалеза (Фиг.6). Иглата се забива бързо в подходящия участък. Върхът на иглата се придвижва в различни посоки, като в същото време буталото на спринцовката се изтегля силно, за да се създаде вакуум. Важна особеност е избягването центъра на по-големите лезии, тъй-като много често той е некротизирал. Извършват се няколко аспирации и иглата се отделя от спринцовката. Върхът на иглата се изважда от лезията, отново се свързва със спринцовката и рязко се продухва съдържанието и върху няколко предметни стъкла. Така полученият материал е готов за по-нататъшно фиксиране и оцветяване.

2.Аспирация чрез "капилярно налягане":

При този метод иглата се забива в желания участък, без да е прикрепена спринцовка към нея (Фиг.5). Върхът на иглата също се движи в различни посоки, като не се всмуква, а клетките навлизат в лумена на иглата на базата на капилярното налягане. По този начин рискът за увреждане на клетките е минимален; минимално е и замърсяването на пробата с кръв. След тази процедура иглата се свързва със спринцовката и материалът се продухва внимателно върху подготвено предметно стъкло.

Проблеми при получаването на материал за цитологично изследване

1.Липса на минимално присъствие на клетки:

Това е може би най-често срещаният проблем при вземането на материала. Причините могат да бъдат няколко. На първо място при някои тъкани (например мезенхимни тумори) клетките се отделят много трудно, понеже са здраво свързани помежду си. Най-добрата стратегия в този случай е да се направят няколко препарата (най-малко 4-6) от различните участъци на лезията. Това може да се получи и тогава, когато упражненото налягане върху спринцовката при аспирирането на материала е недостатъчно. В такива случаи се упражнява по-силно налягане при аспирация и проблемът се разрешава.

2.Контаминация на пробата с кръв:

Две са основните причини за това-използване на игла с голям лумен и удължено време за аспириране на материала. Трябва да се има предвид, че някои тъкани са високо кръвоснабдени и примесването на материала с кръв е трудно да се избегне. В такива случаи се препоръчва аспирация чрез капилярно налягане. Ако се правят отпечатъчни препарати, то задължително кръвта и тъканните течности трябва да се попият, преди да се направи отпечатъка.

3.Некачествено приготвени препарати:

Получаване на качествени препарати за цитологично изследване зависи от правилното провеждане на отделните етапи. Влияние оказват начинът на вземането на материала, фиксирането му и последващото оцветяване. За препоръчване е пробата да се фиксира и оцвети незабавно след вземането на клетките. Ако материалите се обработват в помещение, където има изпарение на формалин се получават некачествени препарати. За да се избегне това материалите за цитологично и хистологично изследване трябва да се изпращат в отделни, добре затворени съдове (формалиновите пари могат да преминат през пластичен материал).

Работа с течни материали

След получаване, течните материали трябва незабавно да се поставят в съд EDTA, за да се избегне образуването на съсиреци. Препаратите се приготвят аналогично на кръвните натривки. Накапва се малка капка от течността на около един сантиметър от края на предметното стъкло. С помощта на второ предметно стъкло, поставено под остър ъгъл материалът внимателно се разстила (Фиг.1). Скоростта на придвижването на предметното стъкло зависи от вискозитета на материала-колкото по-вискозен е материала, толкова придвижването е по-бавно. Материлът може и да се разстеле, като върху капката течност се постави покривно стъкло. По-този начин материалът се разстила равномерно, но методът не е удачен за вискозни течности. Трансудатите и цереброспиналните течности са бедни на протеини и клетъчен състав. В такива случаи се препоръчва ценрофугиране на материала и вземане на утайката за изследване.

Оцветявеане на цитологичните препарати

Най-често в практиката се предпочитат бързи оцветителни методики (в рамките на 2-3 минути). За целта може да се използва Hema- Quik II® (Fisher Scientific International) - алкохолно-базирано оцветяване по Wright`s( Wright`s Stain Solution, Fisher Scientific International ) или Diff-Quik®/Quik-Dip® ( Differential stain set, American Scientific Products) - водно-базираното оцветяване по Wright`s. Ако не се изисква спешна диагностика се препоръчва оцветяване по Wright`s-Giemsa. Водните разтвори по Wright`s дават сходна цитологична картина, както и алкохолните, но са по-скъпи. При диагностиката на мастноклетъчните тумори, особено на по-ниско диференцираните, гранулите в цитоплазмата на клетките не се оцветяват с водни разтвори, а с алкохолни. Оцветяванията по Wright`s-Giemsa и Romanowsky-Giemsa също дават много добри резултати тъй-като боите, които се съдържат в тях оцветяват отлично ядрата и цитоплазмата на клетките. За практически цели може да се оцветява и със New-methylene blue-NMB (Fisher Scientific International). Това боядисване се базира на оцветяването по Romanowsky и е удачно за седимент от урина и за хематологични изследвания. Ако разтвора е водоразтворим той не разтваря липидите и може да се използва при диагностиката на липоми и холестеринови кристали. С това оцветяване се визуализират отлично гъбички и бактерии. Оцветявяне с Oil-Red O се прилага за идентификация на липиди. Оцветяване по Papanicolaou се използват предимно във ветеринарната гинекология. Клетките, оцветени по този метод показват превъзходни ядрени детайли и триизмерност, но поради многостепенността си методът не се е утвърдил извън сферата на гинекологията. Препоръчително е боите да се филтрират всяка седмица, за да се избегне контаминирането им с бактерии или образуването на утайка. При отслабване силата на оцветителите времето за боядисване се удължава или разтворите се сменят своевременно.

Съхранение и изпращане на материал за цитологично изследване

От практическа гледна точка трябва да се знае, че колкото по-рано след фиксирането на препаратите се извърши оцветяването, толкова микроскопската картина е по-добра. Ако оцветяването ще се извърши по-късно препаратите трябва да се съхранят в затворен контейнер, за да се предпазят от действието на пряката слънчева светлина и насекоми. Когато препаратите се изпращат за диагностика в лаборатория, те не трябва да престояват повече от 72 часа. Желателно е заедно с рутинно оцветените препарати да се изпратят и неоцветени за допълнителни изследвания. Материалите за цитологично изследване се придружават със съпроводително писмо. В него задължително се посочват от какво животно (вид, пол, възраст) и от коя телесна област е взет материалът, как е изглеждала изменената част и какви са данните от анамнезата.

Литература

1. Захариев, АК. Клинична цитология, изд.Роял 77, 1995.
2. Allen SW, Prasse KW: Cytologic diagnosis of neoplasia and perioperative implementatation. Comp Cont Ed Pract Vet 8: 72-80, 1986.
3. Boon GD, Rebar AH, DeNicola DB: A cytologic comparison of Romanowsky stains and Papanicolaou type stains. I. Introduction, methodology and cytology of normal tissues. Vet Clin Pathol 11:22-30, 1982.
4. Bottles K, Miller TR, Jeffrey RB: Fine needle aspiration biopsy. Am J Med 81:525-529, 1986.
5. Cardoso PL: Atlas of Clinical cytology, pp.13-52.Netherlands, Targa bv`S-Hertogenbosch, 1976.
6. Cowel LR, Tyler RD, Meinkoth JH, editors: Diagnostic Cytology and Hematology of the Dog and Cat, pp.1-19, St.Louis, CV Mosby, 1999.
7. DeNicola DB: Diagnostic cytology, collection techniques and sample handling.Proc 4th Ann mtg ACVIM, 1987.pp 15-25.
8. Eriksson O, Hagmar B, Ryo W: Effects of fine-needle aspiration and other biopsy procedures on tumor dissemination in mice. Cancer 1984:54: 74-78.
9. Henry MJ, Burton LG, Stanley MW, Horwitz CA: Application of a modified Diff-Quik stain to fine needle aspiration smears. Rapid staining with improved cytologic detail. Acta Cytol 1987;31:954-955.
10. Jorundson E, Lumsden JH, Jacobs RM: Rapid staining techniques in cytopathology: A review and comparison of modified protocols for hematoxillin and eosin, Papanicolaou and Romanowski stains. Vet Clin Pathol 1999; 28:100-108.
11. Kline TA, Neal HS and Holroyde CP: Needle aspiration biopsy: Diagnosis of subcutaneous nodules and lymph nodes. JAMA 235:2848:2850, 1976.
12. Kline TS: Handbook of Fine Needle Aspiration Biopsy Cytology, pp.1-7.St.Louis, CV Mosby, 1981.
13. Koss LG, Woyke S, Olzewski W: Aspiration biopsy: Cytologyc Interpretation and Histologic bases, pp.3-21.Tokyo, Igaku-Shoin, 1984.
14. Linsk JA, Franzen S: Clinical Aspiration Cytology, pp.1-8.Philadelphia, JB Lippincott, 1983.
15. Lowhagen T, Willems J : General commentson aspiration biopsy cytology.In Weid Gl, Koss LG, Reagen JW (eds): Compedium on Diagnostic Cytology, ed. 5, pp.506-511. Chicago, Tutorials of Cytology, 1983.
16. Mejer, DJ: The management of cytology speciment. Compend Contin Educ Pract Vet 1987; 9:10-17.
17. Menard M and Papageorges M: Fine-needle biopsies: how to increase diagnostic yield. Comp Cont Ed Pract Vet 19:738-740, 1997.
18. Meyers DJ and Franks P: Clinical cytology, management of tissue speciment. Mod Vet Pract 67:255-259, 1986.
19. Meyers DJ and Feldman D: Diagnostic cytology in veterinary medicine. Southwestern Vet 25: 277-282, 1982.
20. Meyer DJ, Harvey JW: Effusions.In Veterinary Laboratory Medicine: Interpretation and diagnosis.WB Saunders, Philadelphia, 1998, pp.255-260.
21. Mills JN and Griffiths GL.: The accuracy of clinical diagnoses by fine-needle aspiration cytology. Aust Vet J 61:269-271, 1984.
22. Nguyen GK and Kline TS: Essentials of aspiration biopsy cytology, pp.7-12.Igaku Shoin Medical Publishers, USA, 1994.
23. O`Rourke LG: Cytology technics. Mod Vet Pract 64:185-189, 1983.
24. Raskin RE, Mejer DJ, editors: Atlas of Canine and Feline Cytology. Philadelphia: pp.1-17, W.B. Saunders Company, 2001.
25. Roszel JF: Genital cytology of the bitch. Vet Scope 19:2-15, 1975.
26. Schumann GB, Colon VF: The Clinician`s Guide to Diagnostic Cytology, pp.1-St.Louis, CV Mosby, 1981.