Инструкция за вземане, опаковане и транспортиране на пробите мозък за изпълнение на програмата за надзор на трансмисивните спонгиформни енцефалопатии (ТСЕ)– спонгиформна енцефалопатия по говедата (СЕГ)и скрейпи при овцете и козите

І. Произход на биологичните проби за диагностициране на ТСЕ

За изпълнение на Програмата за надзор върху трансмисивните спонгиформни енцефалопатии (ТСЕ) се взимат проби от главен мозък от следните видове и категории животни:

  1. редовно заклани говеда на възраст над 30 месеца;
  2. редовно заклани овце и кози на възраст над 18 месеца;
  3. заклани по необходимост говеда на възраст над 24 месеца;
  4. заклани по необходимост овце и кози на възраст над 12 месеца;
  5. “прицелни животни”:
    • а/ умрели говеда на възраст над 24 месеца;
    • б/ умрели овце и кози на възраст над 18 месеца;
    • в/ говеда на възраст над 24 месеца внесени от страни с констатирани случай на спонгиформна енцефалопатия;
      • г/ приплодите на говедата по буква “в”, навършили 24 месеца;
    • д/ говеда на възраст над 24 месеца , които са консумирали храни или хранителни смески, за които се предполага, че са били потенциално контаминирани с причинителя на спонгиформната енцефалопатия.

Пробите по т.1, 2, 3 и 4 се вземат от инспекторите от ДВСК в регламентираните кланици. Пробите по т.5 се вземат от ветеринарните лекари от ОВЛ, РВЛ и лицензираните ветеринарни участъци.

ІІ. Вземане и опаковане на диагностични проби от мозък:

1. Вземане на диагностични проби мозък от редовно заклани и заклани по необходимост животни в регламентираните кланици:

Възможно най-бързо след отстраняване на главата на закланите животни, предназначени за изследване, се взима диагностичен материал от главен мозък, като максимално се запазва анатомичната му цялост. Вземането на пробите мозък се осъществява през големия тилен отвор (foramen magnum), съгласно фигура 1.

За целта се използват специални остри метални или пластмасови “лъжици”(фиг. 2).

Последните се промушват през foramen magnum в орална посока между мозъчните обвивки и мозъчния ствол (фиг.3) и чрез циркулярно изрязване се добива каудално разположената анатомично обособена част на мозъчния ствол, включваща obex-a (фиг. 4, а и б).

Получената по този начин диагностична проба се поставя в отделен херметично затварящ се контейнер (пластмасов съд) и незабавно се охлажда до +4°С. При тази температура тя се транспортира в хладилна чанта, най-късно до 72-я час от вземането в охладено състояние до специализираната диагностична лаборатория по ТСЕ – НДНИВМИ град София, бул. “П.Славейков” № 15. Диагностичните проби се изпращат надписани и задължително се придружават от съпроводително писмо (Образец КЗ-23 или Образец КЗ-24, одобрени със Заповед № ХІ-282 от 16.09.2002 г. Идентификационните данни на пробата съдържат: име на стопанина на животното, пълен индивидуален идентификационен номер, възраст, пол и произход на животното и кланица на добив на месото.

За всяка взета и изпратена проба за изследване за спонгиформна енцефалопатия се съставя протокол. Протоколите и екземпляр от съпроводителните писма се съхраняват 7 години.

Ръководителите на месодобивни предприятия са длъжни да осигурят условия гарантиращи запазването и съхранението на добитото месо, субпродукти и технически суровини, получени от животни подлежащи на вземане на проби, както и неизползването им за храна на хора и животни, наторяване, за козметични или медицински цели, до получаване на отрицателен резултат от лабораторното изследване.

2. Вземане на проби мозък от клинично предполагаеми за ТСЕ животни и от умрели животни с неврологични признаци

За всички възрастни животни (говеда или овце и кози), показващи клинични симптоми характерни за ТСЕ или умрели с такива, забелязани от гледачите или лекуващия ветеринарен лекар трябва да се съобщава на съответния държавен ветеринарен лекар от Регионалната ветеринарномедицинска служба, който прилага мерките посочени в Наредбата за профилактика и контрол на ТСЕ.

Ако е възможно животното се диспансеризира във ветеринарна клиника за едри животни за доотглеждане за период от няколко седмици в изолирани помещения при оптимални условия, с оглед евентуалното доразвитие на спонгиформните патогномонични мозъчни промени. По този начин ТСЕ се отдиференцират по-лесно от другите сходно протичащи заболявания. При невъзможност за доотглеждане животното се евтаназира и целия главен мозък, включващ и мозъчния ствол или само мозъчния ствол, добит през foramen magnum се изпращат до специализираната лаборатория по ТСЕ при НДНИВМИ – София за потвърждение.

В документацията на такива диагностични проби трябва да се посочи номерът на идентификационната ушна марка, възрастта, породата и пола на животното, собственикът, данните от анамнезата, проявената клинична картина, епизоотологичната обстановка, патологоанатомичната находка, проведено лечение и евентуалната предварителна диагноза.

ІІІ. Процедури в диагностичната за ВСЕ лаборатория

След пристигането на диагностичната проба в специализираната лаборатория тя трябва да се раздели надлъжно по средната линия на две равни части (Фиг. 4, а и б), при което:

  • Едната половинка (Фиг. 4, а1 и б1), служи за получаване на необходимото количество мозъчна тъкан от областта на obex-а, следвайки инструкциите за изпълнението на съответния специфичен скринингов тест, който ще се използва. Остатъците тъкан от тази половинка трябва да се съберат и се съхраняват при +4°C до получаване на резултатите от бързият тест;
  • В случай на съмнителен или положителен резултат от скрининг теста, област от obex-a от тази половинка (виж фиг. 4, а2 и б2) трябва незабавно да се фиксира в 10% формалин, приготвен по следния начин: Фиксаторът (10%-я разтвор на формалин), се приготвя чрез разтваряне на 8,5 g натриев хлорид в 900 ml дестилирана, вода и се смесва с 100 ml търговски формалин, представляващ 37 до 40% разтвор на формалдехид, така че в крайния работен разтвор концентрацията на формалдехида да е между 3,7 до 4%.
  • Остатъците необработена тъкан от двете половинки се запазват и могат да се използват за повторни или допълнителни изследвания, до излизане на окончателния резултат. След приключване на изследванията пробите се унищожават по начин гарантиращ инактивирането на приона.
  • Всички писма, резултати и разпечатки от извършените изследвания с всеки един от методите се съхраняват най-малко 7 години в архива на лабораторията.

Диференциална диагноза

Клинично предполагаемата диагноза ТСЕ (СЕГ или скрейпи) трябва да бъде потвърдена следсмъртно чрез някой от утвърдените тестове в специализираната лаборатория.

В диференциално-диагностично отношение трябва да се имат предвид и при нужда да се извършат изследвания, изключващи:

  • Хипомагнезиемията;
  • Нервната форма на ацетонемията;
  • Парезите следствие хипокалцемия;
  • Енцефалитната листериоза;
  • Беса;
  • Болестта на Ауески;
  • Отравяния (оловно, ботулизъм);
  • Заболявания на гръбначния стълб.

Златни стандарти за диагноза на ТСЕ

Понастоящем международно възприети златни стандарти за окончателна ТСЕ диагноза са имунохистохимичното доказване на наличието на PrPSc или патохистологичното установяване на вакуолизации в гъстата мрежа от неврони и глия (анатомично обособените ядра) в областта на obex-a.

ІV. Транспортиране на взетите проби

Взетите проби се съхраняват и транспортират в хладилна чанта, като същите се придружават със съпроводителни писмо по образец (Съпроводителни писма – Образец КЗ-23 и Образец КЗ-24, одобрени със Заповед № ХІ-282 от 16.09.2002 година.

Регионалните ветеринарномедицински служби съвместно със собствениците на кланици организират, клането на посочените в Раздел І животни в точно определени дни, вземат и изпращат пробите за изследване в НДНИВМИ гр.София, като няколко съседни РВМС се комбинират и използват един транспорт.

Линии за транспортиране на проби за изследване:

  • Видин, Монтана и Враца
  • Добрич, Варна, Шумен, Търговище, Велико Търново
  • Габрово, Ловеч
  • Силистра, Русе, Плевен /Разград носи пробите в Русе или Търговище/
  • Благоевград, Кюстендил
  • Перник
  • Костинброд
  • Смолян, Пловдив, Пазарджик
  • Бургас, Сливен, Стара Загора /Ямбол носи пробите в Сливен/
  • Кърджали, Хасково

V. Обучение на ветеринарните лекари, които ще вземат пробите

ГУ на НВМС организира курс за обучение на определените ветеринарни лекари които ще вземат пробите в кланиците и на терена за начина на вземане, опаковане и транспортиране на пробите по РВМС, по график.

За провеждане на обучението са необходими: видеоматериали и видеотехника за теоретичната част и глави от едри и дребни преживни животни – кланичен добив /без език и масетери/ за практическата част.

Изображения

Фиг. 1. Голям тилен отвор (foramen magnum), през който се взима диагностич-на проба (мозъчен ствол), служеща за диагностика на ТСЕ.Правоъгълникът очертава анатомично обособените части, които пробата трябва да включва. Фиг. 2. Метална и пластмасова лъжици на фирмата Prionics за получаване на диагностичен материал от мозъчен ствол през foramen magnum. Фиг. 3. Получаване на диагностичен материал от мозъчен ствол през foramen magnum. Фиг. 4 (а и б) . Диагностична проба от мозъчен ствол, получена през foramen magnum. Едната половинка (1) се използва за изпълнение на бърз тест, а участъка от областта на obex-a на другата (участък 2) при съмнителен или положителен резултат се фиксира в 10% формалин и служи за допълнителни хистологични и имунохистохимични изследвания. Пинцетът (а) сочи нивото на obex-a. Другата половинка, също се съхранява при +4°C, докато скрининг теста приключи. Фиг. 4 (а и б) . Диагностична проба от мозъчен ствол, получена през foramen magnum.Едната половинка (1) се използва за изпълнение на бърз тест, а участъка от областта на obex-a на другата (участък 2) при съмнителен или положителен резултат се фиксира в 10% формалин и служи за допълнителни хистологични и имунохистохимични изследвания. Пинцетът (а) сочи нивото на obex-a. Другата половинка, също се съхранява при +4°C, докато скрининг теста приключи.